Nucleotyping

Prosjektet skal bidra til forståelsen av hvilken rolle epigenetiske forandringer og storskala genom instabilitet spiller under kreftutvikling, med særlig vekt på endringer i DNA organisasjon og kromatin struktur.

Vi håper å utvikle nye prognostiske og prediktive markører for diagnose og behandling av kreft.

Av John Arne Nesheim og Maria Pretorius, Oslo universitetssykehus

En av de største utfordringene innen onkologien er selvfølgelig å velge rett behandling for hver enkelt pasient. Dette betinger at man skal kunne forutsi resultatet av en gitt behandling for pasienten. For de fleste krefttyper finnes det en rekke forskjellige behandlinger og valg, alt fra å avvente videre utvikling via konservativ kirurgi for fjerning av tumor, til kompleks multimodal behandling med kirurgi, medikamentell behandling og/eller stråling. I de fleste tilfeller finnes det ingen pålitelig metode for å forutsi den enkelte pasients kliniske forløp og respons. Epidemiologisk og statistisk blir sannsynligheten for 5 års overlevelse beregnet på basis av klinisk stadieinndeling, hvor overlevelse typisk varierer fra 60-95% i Stadium I og 5-20% i Stadium IV. I hovedsak finnes det ikke pålitelige metoder for å forutsi om den enkelte pasient tilhører den gruppen som overlever (god prognose) eller dør av sykdommen innefor hvert av disse kliniske stadier. En god prognostisk eller prediktiv markør ville muliggjøre en mer optimal behandling for den enkelte pasient, med økte muligheter for helbredelse med færre bivirkninger og langtidskomplikasjoner, eller en forbedring av livskvalitet for de som ikke kan kureres kombinert med reduserte kostnader til behandling som allikevel ikke hjelper. Betydningen av, og behovet for, gode prognostiske markører kan vanskelig overdrives.

Nucleotypingprosjektet er basert på konseptet om genom instabilitet i kreft, og som sådan helt i overensstemmelse med dagens forståelse og teorier om kreftutvikling. Nucleotyping klassifiserer en tumor basert på kvalitative og kvantitative analyser av DNA- og kromatinstruktur i tumorens cellekjerner ved hjelp av avansert høyoppløselig digital bildeanalyse. Det grunnleggende konseptet er at tumorer med unormalt DNA innhold og/eller ustabil kromatinstruktur er i et mer avansert stadium og vil derfor med større sannsynlighet ha mikrometastaser. Metodene er utviklet i retrospektive studer av kreftpasienter med kjent sykdomsforløp. Dette innebærer at man identifiserer en kombinasjon av egenskaper som beskriver DNA- og kromatin status ved diagnosetidspunktet, og deretter etterprøver disse egenskapenes evne til å forutsi pasientens videre forløp.

Nucleotyping er et ambisiøst prosjekt, både når det gjelder SW-utvikling, krav til hardware og de vitenskapelige forventningene. Prosjektet har en lang historie, men har hatt fornyet fokus fra høsten 2004 etter etableringen av Institutt for medisinsk informatikk. Siden den gang har flere applikasjoner kommet til, og et nytt system for produksjon av data har blitt utviklet. Med produksjon av data menes hele gangen fra skanning av et snitt med slideskanner og lysmikroskopsystemer til utregning av egenskaper for hver enkelt kjerne og visning av disse på tilhørende skan. Herunder hører også andre prosjekter som for eksempel segmentering, nye teksturmetoder, komparative analyser, pseudoploidi og MicroTracking. Flere store kliniske materialer er innsamlet og preparert ved Cytometrilaboratoriet, og analysert med våre nye metoder og verktøy. Både Seksjon for interfasegenetikk og Seksjon for anvendt informatikk jobber aktivt med Nucleotyping-prosjektet.

Metoder
Vevsmaterialet som velges ut til nucleotyping må gjennom en omfattende bearbeiding på laboratoriet før man kan beskrive DNA og kromatinstatus. Det er i dag to måter man kan gjøre nucleotypingmålinger på; monolayer og snitt. For begge metodene bruker vi formalinfiksert, parafininnstøpt materiale som utgangspunkt.

Monolayer består av isolerte, hele cellekjerner som legges i ett lag på glass. Det aktuelle vevsområdet mikrodissekeres ut fra parafinblokken og cellene lyses og prepareres slik at man sitter igjen med en suspensjon av kjerner. Videre farges cellekjernene med Feulgen-Schiff som binder seg til DNA. Det fargede monolayer legges under lysmikroskopet og kjernenes DNA-innhold kan analyseres ved bruk av forskjeller i gråtoneverdier i hver enkelt cellekjerne. Alle cellekjerner segmenteres automatisk og kvalitetssikres før egenskapene regnes ut og de avsluttende analysene gjøres. Fordelene med en slik metode er at man måler hele intakte kjerner, og disse kan identifiseres automatisk ved hjelp av enkle bildeanalytiske metoder (tersklingsmetoder). Ulempene med metoden er først og fremst at man mister den histologiske informasjon og mulighetene for å relatere analysene til annet enn andre kjernemarkører.

Ved bruk av snitt, snittes parafinblokken i 5um tykke lag som legges på glass. Snittene farges med Hematoksylin og Eosin (HE) for å få fram vevsarkitekturen. Snittene skannes og gjøres digitale ved hjelp av Nanozoomer (virtuelt mikroskop). Videre fjernes HE-fargen og snittet farges på nytt med Feulgen-Schiff. I likhet med HE, skannes også denne på Nanozoomer. En patolog merker det aktuelle området digitalt ved bruk av HE-skannet. Disse koordinatene mates videre inn i lysmikroskopet, som vil måle det aktuelle området. Cellekjernene segmenteres automatisk og kvalitetssikres før avsluttende analyser. Fordelen ved bruk av snitt er at enkeltkjernene kan spores tilbake til sin opprinnelige posisjon i HE-skannet. Dette kalles Microtracker. Bildeanalytisk er det imidlertid store utfordringer, spesielt med segmentering (identifisering) av de enkelte kjerner, og metoden krever lang mer avansert bildeanalyse og vesentlig mer regnekraft (dvs kraftigere datamaskiner).

Teknisk Utvikling
Nucleotyping er et teknisk krevende prosjekt både når det gjelder software og oppsett av utstyr og hardware. Det er utviklet en rekke applikasjoner spesielt for å støtte dette prosjektet og det er satt opp egen dedikert hardware for å generere og lagre data.

Hardware
Rådata i prosjektet er bilder av forskjellige typer. Vi benytter både scannere og mikroskop for å generere disse bildene. Det genereres enorme mengder data og det er satt opp et eget SAN med backup for en sikker lagring av disse dataene. Flere virtuelle servere sørger for et ryddig og effektivt oppsett for både brukere og drift. Stor regnekraft er også nødvendig for behandling og videre analyser av bildene. Til dette formål har vi satt opp et cluster av Linux-maskiner.

Applikasjoner og software-utvikling
De fleste av applikasjonene er utviklet i og for et normalt Windows-miljø. Visual Studio og .net brukes som verktøy. Mesteparten av koden er skrevet i C#, men tyngre, krevende og andre utvalgte algoritmer er tatt ut og implementert i C++. Vi har fokus på både kvalitetsikring av dataene og god ytelse. Viktige egenutviklede applikasjoner og software er

Verktøy for å muliggjøre scanning og grabbing av data
Kontroll av mikroskop og grabbing av bilder
Verktøy for overføring av data mellom systemer på en sikker måte
NWS: Nucleotyping WorkStation. Visning, kvalitetsikring og redigering av data
RUST: Researchers Utility Software Tool. En verktøykasse for forskeren: Analyser, microtracking, statistikk, visualisering, etc.
Cluster-kode: Segmentering, utregninger av egenskaper, etc.

Vi benytter flere hjelpeverktøy for å gjøre vår kode så god som mulig. Noen eksempler er: MatLab, TeeChart, OpenCV, SubVersion, IPP, VTK. En forutsetning i et prosjekt som dette er at den tekniske utviklingen er smidig og foregår i et tett samarbeid med brukere og forskere.

Segmentering
Bildesegmentering er et av de viktigste og vanskeligste stegene i automatisk bildeanalyse. Vi ønsker å utvikle metoder for automatisk segmentering av kjerner i histologiske snitt. I monolayers kan kjernene ofte segmenteres vha. en enkel automatisk gråtoneterskling. Segmentering av kjerner i histologiske snitt er generelt vanskelig, og det er ofte nødvendig å bruke interaktive teknikker for å oppnå tilfredsstillende resultat. Det er imidlertid ønskelig å automatisere segmenteringen mest mulig. Segmentering er et stort fagfelt innen digital bilde-analyse og det pågår en stor forskningsaktivitet innen feltet. Aktive konturer (”snakes”) er populære og lovende metoder for segmentering av objekter i medisinske bilder. En algoritme for segmentering av kjerner i histologiske snitt basert på aktive konturer består av flere steg: filtrering for å fjerne støy i bildet, deteksjon av kjerner, kantdeteksjon for å fremheve kanter (kjernekonturen), initialisering av aktive konturer (dette kan sees på som en grov segmentering av kjernene) og deformering av aktive konturer (for nøyaktig segmentering av kjernene). Segmentering av kjerner i klynger må sees på som et separat problem, og spesialtilpassede metoder må utvikles for å løse dette problemet. Vi har nå fått et betydelig gjennombrudd i denne forskningen og har lykkes med å utvikle en sekvens av metoder som fungerer meget godt på epiteliale prostatakjerner i snitt. Metoden patenteres og publiseres våren 2009.

Trening- og testsett på kliniske materialer
Nucleotyping innebærer å finne frem til en kombinasjon av egenskaper i kjernen som best beskriver kjernens tilstand i forhold til et gitt mål eller en hypotese. Vi fokuserer på egenskaper som kan måle genomets stabilitet, da vi jobber ut i fra den hypotese at genom instabilitet er en drivkraft i kreftutvikling. Kjernens DNA- og kromatin struktur varierer selvfølgelig med kjernens spesifikke funksjon i det enkelte vev, og er naturlig nok forskjellig i forskjellige vevstyper. En må derfor først trene egenskapene i forhold til kjente funksjoner eller tilstander for å finne de egenskapene som best beskriver den aktuelle funksjon eller tilstand. Når vi eksempelvis tester ut en gruppe egenskaper på deres evne til å forutsi et sykdomsforløp (prognose) så leter vi etter en kombinasjon av optimale egenskaper i en del av et materiale hvor sykdomsforløpet til hver pasient som inngår er entydig og kjent. Dette er treningssettet. Her kan vi tillate oss å tilpasse egenskapene (etter strenge og veldefinerte metoder) til vi klarer å skille mellom prøver fra pasienter med henholdsvis god og dårlig prognose. Deretter må vi etterprøve og verifisere resultatet ved å applisere den samme egenskapskombinasjonen blindt på et uavhengig materiale av samme type. Det fremgår av ovenstående at hver krefttype og/eller prepareringsmetode krever egne trenings- og testsett. Vi har i hovedsak fokusert på store sykdomsgrupper, og har translasjonsprosjekter gående for prostatakreft, tykktarmskreft, brystkreft og gynekologisk kreft.

Teksturegenskaper og metoder
Vi har utviklet våre egne bildeanalytiske systemer fra grunnen av, og disse inneholder en valgfri kombinasjon av om lag 35 forskjellige egenskaper, hvorav de fleste er teksturegenskaper. I hovedsak er disse hentet fra enten Gray Level Coocurrence Matrix, Grey Level Run Length Matrix, eller vår egen Grey Level Entropy Matrix. De fleste av disse kan anvendes med 7 forskjellige gråtoneoppløsninger og 13 forskjellige vindustørrelser (en vindustørrelse på 3 vil si et område med 3x3=9 pixler eller bilde¬elementer) slik at vi teoretisk har over tusen egenskapsvarianter som kan brukes i millioner av kombinasjoner. Utfordringen er å finne en kombinasjon av et lite antall egen¬skaper som scorer godt i det endelige testsettet. Å finne den rette egenskaps-kombinasjonen for en krefttype er således et omfattende arbeid som ofte initierer ny utvikling, og en treningssett- analyse kan ta mange måneder. Det avgjørende testsettet kjøres derimot på timer eller få dager.

Vårt mål er å utvikle metoder for teksturanalyse som kan måle og beskrive endringer i kromatinstruktur under kreftutvikling. Slike analyser kan gi prognostisk og prediktiv informasjon om pasienter med tidlige stadier av kreft og derved bidra til å skreddersy behandlingen til den enkelte pasient. Innen feltet digital patologi er det vanlig å trekke ut et stort antall teksturegenskaper fra et begrenset pasientmateriale. Det velges så en ”optimal” kombinasjon av egenskaper som skal benyttes til å klassifisere pasienter. Det oppstår da lett en overtilpasning til treningsdataene, og teksturegenskapene generaliserer dårlig til senere bruk på store kliniske pasientmaterialer. Vi utvikler metoder for å trekke ut et lite antall adaptive teksturegenskaper som kompakterer den teksturinformasjonen som skiller klassene på en nær optimal måte. Vi har funnet at de nye, adaptive teksturegenskapene gir bedre klassifikasjonsresultater enn klassiske teksturegenskaper. Metodene gir også et verktøy for å beskrive teksturforskjellen mellom klassene.

Vi har utviklet en rekke teksturegenskaper med dokumentert diagnostisk og/eller prognostisk verdi, og for en del av disse har vi en overordnet forståelse av hvilke type funksjonelle kromatinforandringer de beskriver. Imidlertid har vi fortsatt en lang vei å gå før vi er i stand til detaljert å forstå sammenhengen mellom strukturelle og funksjonelle endringer i kromatinet. En vei vil være å identifisere alle kjerner med en gitt egenskapsverdi i histologiske snitt, og for dette formål har vi utviklet prosjektet Microtracker En annen vei vil være å visualisere den enkelte teksturegenskap direkte i den kjernen som måles, ved å farge eller på annen måte merke den delen av kromatinet som gir det aktuelle teksturmål.

Videre arbeid
For å bedre forstå sammenhengen mellom strukturelle og funksjonelle endringer i kromatinet ønsker vi å sammenstille og sammenligne resultater fra teksturegenskapene med DNA ploidi, CGH og FISH.

Tissue Micro Array (TMA) er en metode hvor vev fra opp til 500 forskjellige parafinblokker samles i en og samme resipientblokk. Vi vil i nær fremtid forsøke å tilpasse systemet til å måle nucleotyping på TMA.
Visualisering av teksturegenskaper
Microtracking på parallelle snitt - Macrotracking

Publisert 05.07.2011 16:05 | Endret 21.06.2012 15:37

Relaterte lenker

Medinfo.net

About the Nucleotypingproject

Relaterte enheter

Institutt for medisinsk informatikk

Nettstedskart|Kontakt Oss|Personvern |

Facebook |

Twitter

Oslo universitetssykehus HF | Telefon sentralbord: 02770 (fra utland: +47 915 02770)
e-postmottak:post@oslo-universitetssykehus.no (Henvendelsen må inneholde fullt navn og postadresse. Personlige spørsmål av medisinsk art kan dessverre ikke besvares per e-post)
Postadresse: Postboks 4950 Nydalen, 0424 OSLO | Besøk: Kirkeveien 166 (Ullevål sykehus) Bygg 1, 1. et.
Organisasjonsnummer: 993 467 049 | Nettredaktør: Ingvild Utne