RBC-genotyping kan være aktuelt for pasienter med videre transfusjonsbehov når pasienten

• er immunisert, nylig transfundert og/eller er DAT positiv
• har multiple blodtypealloantistoffer
• har autoantistoffer hvor serologisk fenotyping ikke kan utføres
• har langvarig (noen ganger livslangt) transfusjonsbehov, for eksempel pasienter med thalassemier om de ikke er utvidet fenotypet før første transfusjon. Om pasienten ikke har fått fenotypelikt blod i flere år og ikke har dannet blodtypeantistoff, ansees ikke genotyping som hensiktsmessig

eller når

• det er vanskelig å få tilstrekkelig prøvemateriale til serologisk fenotyping
• kommersielle reagenser til fenotyping ikke er tilgjengelig
• serologisk typing er uklar

HPA-genotyping ved føtal neonatal alloimmun trombocytopeni (FNAIT) og ved mistanke om post-transfusjonspurpura (PTP), hvor det er nødvendig å skaffe forlikelige trombocyttkonsentrater.

Neutrofil granulocytt-genotyping på HNA-3 ved mistanke om transfusjonsrelatert akutt lungeskade (TRALI).

Innsending av prøver

Prøvemateriale og rekvisisjon:

• Minimum 3 ml EDTA-blod
• Uåpnet glass foretrekkes, men ved mangel av dette aksepteres åpnet glass

• Bruk rekvisisjon «Rekvisisjon seksjon for immunhematologi fra andre blodbanker» (link til rekvisisjons punktet), kryss av på genotyping og oppgi kliniske opplysninger.

Forventet svartid ca. 7-14 dager.

NB! Oppgi kliniske opplysninger som vil hjelpe oss med riktig prioritering.

Mer informasjon om blodtypesystemer og genotyping

Det finnes 346 kjente blodtypeantigener, 322 av disse er fordelt på 36 blodtypesystemer. Det er ikke mulig å finne allogent blod som vil være fullstendig forlikelig på alle disse antigenene. Alle pasienter skal, i henhold til dagens krav, transfunderes med ABO og RhD forlikelig blod. I tillegg skal kvinner i fertil alder (<50 år) få K negativt blod når de selv er K negative. 
 
Det molekylære grunnlaget for de fleste blodtypeantigenene er kjent, noe som gjør RBC-genotyping mulig. I mange blodtypesystemer er forskjellen mellom antigenene forårsaket av én enkelt forandring i DNA-sekvensen i blodtypegenet, en såkalt singel nukleotid polymorfisme (SNP). Derfor er det som regel enkelt å predikere fenotypen fra genotypen. Enkelte andre blodtypesystemer er derimot mer komplisert, slik som ABO-, H-, I-, GLOB-, Rh- og MNS-systemer. I ABO, H, I og GLOB er ikke antigenet det primære genproduktet, det er derfor en indirekte sammenheng mellom genotype og fenotype. I Rh- og MNS-systemet er det homologe gener, som gjør at det kan skje utveksling av DNA-sekvenser mellom genene, og dermed dannes variantgener og nye antigener. I tillegg finnes det mutasjoner som fører til at et antigen ikke alltid uttrykkes, det gir ekstra utfordringer når fenotype skal predikeres fra genotype.

Tidligere har genotyping primært blitt utført i enkelte pasientprøver som ledd i utredning ved tilfeller med uklar og ikke-konklusiv serologi. Nye teknikker for genotyping, såkalt high-throughput genotyping, har åpnet opp for muligheten til å gjøre blodtyping på en rask og standardisert måte. Dette har ført til at man i dag kan gjøre en utvidet typing av blodgiverkorpset, noe som bidrar arbeidet med å finne typelikt blod til pasienter hvor dette er indisert.

Nye blodtypeantigener, nye systemer og ny nomenklatur; Bioingeniøren 3, 2014, side 22-26.

Genteknologien inntar blodbankene; Bioingeniøren 4, 2014, side 14-16.

 Våre metoder for RBC- og HPA-genotyping

 
Det finnes flere kommersielle systemer for high-throughput genotyping. Avdelingen bruker ID Core XT  fra Progenika/Grifols og ulike FluoGene-kit fra inno-train.

ID Core XT er basert på xMAP teknologi og kombinerer PCR og analyse på Luminex. Det er mulig å analysere 47 prøver parallelt med bestemmelse av 29 SNPer og 37 antigener i hver prøve.

FluoGene kombinerer SSP-PCR og endepunkt fluorescence detection og avleses på FluoVista. Følgende kit brukes i utredningene:

• RBC-FluoGene ABO basic
• RBC-FluoGene vERYfy
• RBC-FluoGene Rare
• RBC-FluoGene CDE
• RBC-FluoGene D weak/variant
• HPA-FluoGene
  

​​​Variant D (=Variant RhD)

Ca. en prosent av den europeiske befolkningen har en variant D egenskap som er et samlebegrep for svak og partiell D. Individer med svak D type 1, 2, 3 og 4 utgjør ca. 80-95 % av alle de med variant D egenskap, og disse er ikke i risiko for å danne alloanti-D.  Individer/pasienter med disse D-egenskapene vil derfor ikke trenge profylakse med anti-D immunglobulin i svangerskap med et RhD positivt foster eller etter fødsel (post-partum), heller ikke ved transfusjon av RhD positive trombocytter.

Pasienter med svak D type 1, 2 og 3 kan få RhD positive erytrocyttkonsentrater, dermed kan verdifullt RhD negativt blod spares til de pasientene som virkelig trenger det. Kun 15% av befolkninger er RhD negativ, dermed er denne blodtypen en begrenset resurs. I og med at man primært ønsker å fastslå svak D type 1, 2 og 3 eller fravær av disse, har vi kalt utredningen «svak D-utredning», men det vi gjør er egentlig en «variant D-utredning».

Grupper hvor variant D-utredning ved genotyping er indisert:

1. Gravide med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing  
ABO og RhD-typing samt antistoffscreening utføres rutinemessig i første prøve i svangerskap. Viser RhD-typing svak reaksjon (≤ 2+), sendes prøven til svak D-utredning ved Nasjonal kompetansetjeneste for blodtypeserologi, FoU, Ullevål, OUS for å identifisere gravide med svak D type 1, 2 eller 3.

Dersom svak D type 1, type 2 og type 3 ikke påvises, vil dette tolkes dithen at den gravide har en annen variant D. Gravide med en annen variant D skal følges opp i henhold til gjeldende rutine for RhD negative (jmf. algoritmene ved foster RHD-typing); med ny antistoffscreening i svangerskapsuke 24 og RhD-profylakse i svangerskapsuke 28. Foster RHD-typing vil i disse tilfellene ikke være hensiktsmessig i og med at morens RHD-gen vil maskere amplifisering av et evt. RhD positivt foster og resultatet vil være inkonklusivt.

NB! Husk at foster RHD-genotyping vil være inkonklusiv dersom en helt vanlig RhD positiv prøve analyseres, fordi morens RHD-gen vil amplifiseres omtrent samtidig med kontrollgenet. Slike prøver skal ikke sendes til foster RHD-genotyping i og med at det vil kunne føre til at en RhD positiv gravid får anbefalt og administreres anti-D immunglobulin (profylakse). Nasjonal kompetansetjeneste for blodtypeserologi, FoU forutsetter at prøver som sendes til foster RHD-genotyping fra andre blodbanker er serologisk RhD negative.

2. RhD negative gravide hvor foster RHD-typing gir inkonklusivt resultat:
Gravide med en RhD-variant som ikke oppdages serologisk, dvs. de types til RhD negativ, mens foster RHD-typing i svangerskapsuke 24 blir inkonklusiv: Denne gruppen av gravide er serologisk RhD negative på grunn av et RHD-gen som ikke uttrykkes eller uttrykkes svakt på overflaten til erytrocyttene. Morens RHD-gen vil i disse tilfellene amplifiseres i PCR-reaksjonen og vil maskere for en evt. foster RHD-positiv reaksjon. Analysen blir derfor inkonklusiv. Ved inkonklusivt resultat på foster RHD-typingen utført ved Helse Nord, -Midt og -Vest, sendes prøven videre til OUS for svak D-utredning.

3. Jenter og kvinnelige pasienter i fertil alder med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing:
Jenter og kvinner i fertil alder (<50 år) med svak reaksjon (≤ 2+) ved serologisk RhD-typing utredes med tanke på svak D type 1, type 2 eller type 3. Ved eventuelt transfusjonsbehov eller svangerskap vil da pasienten/kvinnen få RhD positive blodkomponenter og vil slippe RhD-profylakse dersom svak D type 1, type 2 eller type 3 påvises.

4. Kvinnelige blodgivere i fertil alder med svak reaksjon ved serologisk RhD-typing:
Kvinnelige blodgivere i fertil alder (<50 år) med svak reaksjon (≤ 2+) ved serologisk RhD-typing, når DVI ikke påvises, vil svak D-utredning avklare om blodgiveren er svak D type 1, type 2 eller type 3.  De med svak D type 1, type 2 eller type 3 kan betraktes som RhD positive som gravid eller pasient ved eventuelt transfusjonsbehov. De vil da kunne spares for RhD-profylakse prenatalt, post-partum, og i forbindelse med transfusjon av RhD positivt trombocyttkonsentrat.

Prøvemateriale:
Minimum 3 mL EDTA-blod. Ønskelig med ferskest mulig prøvemateriale. Uåpnet prøveglass foretrekkes, men ved mangel av dette kan også åpnet glass aksepteres.

Fyll ut rekvisisjonen rekvisisjon for immunhematologisk utredning: https://ehandboken.ous-hf.no/document/136841

• Kryss av for genotyping, og spesifiser at det gjelder svak RhD-utredning
• Husk å legge ved utskrift av serologisk RhD-typing.

Svartid; ca. 4 uker fra vi mottar prøven. Ved inkonklusiv foster RHD-typing bør RhD-profylaksen gis i svangerskapsuke 28, dersom resultatet av svak D-utredning ikke foreligger tidsnok.

Generelt

D-antigenet inneholder over 30 epitoper. Varianter oppstår når disse epitopene er svakt uttrykt (Svak D) eller når noen epitoper mangler (partiell D). Selv om begrepene svak og partiell D defineres som foreldet og ikke anbefales å brukes lenger, har disse en viss praktisk verdi, men skillelinjene er ikke eksakte lenger. Man trodde tidligere at svak D'er ikke kunne danne alloanti-D fordi de har alle epitopene, men det er vist at så ikke er tilfelle. Samlebegrepet variant D er anbefalt å bruke nå. Det er viktig å utrede svake reaksjoner (≤ 2+) for å kunne gi persontilpasset oppfølging hos gravide og til jenter samt kvinnelige pasienter i fertil alder i forbindelse med transfusjon.

Svak D: Alle epitopene er til stedet, men de er svakt uttrykt. Den typiske årsaken er en enkel aminosyreendring i den transmembrane eller intracellulære regionen av RhD-proteinet. Dette påvirker/ reduserer uttrykket av RhD i erytrocyttmembranen. Tidligere var det tenkt at de svake D'ene ikke kunne danne alloanti-D i og med at alle epitopene er til stedet, men senere ble det vist at en del/flere svake D'er (f.eks. svak D type 4, 11, 15, 21 og 57) har dannet og kan danne alloanti-D. Undergruppene til svak 4 er under overvåkning og det er ennå ikke konsensus om håndtering av disse, derfor inntil videre anbefaler vi at de behandles/betraktes som RhD negative.  

Partiell D: Partielle D'er mangler én eller flere D-epitoper og kan reagere vanlig eller svakere med anti-D reagens. Reaksjonsstyrken for en og samme prøve kan variere med forskjellige reagenser f.eks. 1+ med et reagens og 3+ med et annet. Enkelte partielle D'er oppstår pga. såkalt hybridprotein hvor enkelte eksoner i RHD-genet er erstattet med RHCE-genets eksoner. 

Referanser:

Blood Group Antigen Facts Book, Reid ME, Lomas-Francis C, Olsson ML, Third Edition 2012

Geoff Daniels, Variants of RhD--current testing and clinical consequences - PubMed (nih.gov) British Journal of Haematology 2013

Virk M & Sandler SG, Rh Immunoprophylaxis for Women With a Serologic Weak D Phenotype - PubMed (nih.gov), Lab Med 2015