DNA-analyser

​

Biologiske sporprøver er prøver som er sikret fra et åsted, eller fra gjenstander knyttet til et åsted. Det kan også være prøver fra impliserte personer i et anmeldt forhold. Med personprøve menes DNA-prøve fra en person, for eksempel en siktet. Her benyttes standardiserte prøvetakingssett. DNA hentes ut av cellene ved å bryte opp cellemembranen. Deretter beregnes mengde DNA i prøven før man bruker Polymerase Chain Reaction (PCR) som kopierer små stykker av DNAet. I alle celler, foruten kjønnscellene, finnes det to kopier av DNA; en kopi fra mor og en fra far. For hver DNA-bit som undersøkes har man derfor to varianter som kalles alleler. For å generere en DNA profil benyttes den delen av DNA som ikke inneholder informasjon om personlige egenskaper eller mulige sykdomsanlegg. Kjønnsmarkører er et unntak fra dette. Områdene i DNA som undersøkes kalles Short Tandem Repeats (STR). Dette er stykker av DNA som består av korte, repeterte enheter. Man kan ha ulikt antall repetisjoner av hver markør og når man undersøker tilstrekkelig mange markører vil dette være nok til å generere en unik DNA-profil. Profilen fremstilles som en tallrekke der de ulike markørene har et navn og tallrekken indikerer alleler med likt eller ulikt antall repeterte enheter. Antall repeterte sekvenser viser stor variasjon mellom ulike personer og er derfor identifiserende.

Det benyttes det rutinemessig 17 DNA-markører i rettsgenetiske analyser hvorav den ene markøren viser kjønn. De 17 markørene anbefales av det internasjonale fagmiljøet og Interpol, og Oslo universitetssykehus følger Europeisk standard for DNA-analyse (ESS).

Prosesseringen fram til en DNA profil består av flere laboratorietekniske trinn før den endelige DNA profilen foreligger. 

Ekstraksjon

Prosessen ved å hente genomisk DNA ut fra cellens kjerne og skilles det fra det øvrige biologiske materialet kalles ekstraksjon. Det finnes ulike metoder og teknikker for å ekstrahere DNA fra ulike celletyper, eksempelvis blod- og epitelceller versus sædceller.

I prøvemateriale der både sædceller og epitelceller er påvist benyttes en metode som omtales som differensiert fraksjonering hvor man søker å lage to fraksjoner; en med sædceller og en med epitelceller, ved hjelp av ulike kjemiske teknikker. Begge fraksjonene kan benyttes til en DNA analyse.

Cellene lyseres ved bruk av varme sammen med enzymatisk behandling (Proteinase K). Tid og enzymkonsentrasjon bestemmes av hvilken celletype man jobber med. Sædceller har en mer resistent cellemembran enn epitelceller og krever høyere enzymkonsentrasjon for lysering. Dette kan man benytte seg av for å skille disse to celletypene fra hverandre.

Ved lysering benyttes ofte Chelex resin som en forberedelse til PCR. Chelex binder magnesium som er en essensiell kofaktor for DNaser. Ved å fjerne magnesium hindres degradering av DNAet.

Kvantitering

Ved mengdebestemmelse brukes en kvantitativ PCR (real time PCR). Reaksjonen har humanspesifikke primere for et kort og et langt fragment, samt primere for Y kromosomet. I denne analysen brukes en fluoreserende probe (TaqMan) der mengde fluoresens korrelerer med mengede DNA i prøven. Denne sammensetningen av primerpar vil gi informasjon om total mengde humant DNA, tilstedeværelse av mannlig DNA og om DNAet har god kvalitet eller om det er helt eller delvis degradert. Konsentrasjonene brukes til å avgjøre hvilke prøver som skal gå videre til STR-analyse og hvor mye templat man skal tilsette av hver enkelt prøve.

PCR

Etter ekstrahering og kvantitering anvendes PCR for å øke antall kopier av DNA-allelene for hver markør. En PCR reaksjon består i hovedsak av DNAets byggesteiner (A, G, C og T), et enzym (polymerase) som kan sette basene sammen og primere; korte DNA stykker som gjenkjenner hvilke deler av DNA som skal kopieres opp. Ved hjelp av temperaturer som danner sykluser vil kopieringsprosessen sørge for en eksponentiell mangfoldiggjøring av allelene. Primerene har fluoreserende fargestoffer bundet til seg slik at det skal være lett å skille de ulike markørene fra hverandre.

Kapillær elektroforese

DNA allelene i markørene har ulike lengder og skilles på størrelse ved hjelp av kapillærelektroforese. De enkelttrådete DNA fragmentene er negativt ladet og vil vandre gjennom kapillærene mot positiv pol, fra anode til katode. Kapillærene er fylt med en polymer som danner en separasjonsmatrix slik at de korte fragmentene beveger seg raskere enn lengre fragmenter. Fargemarkørene detekteres ved hjelp av laseroptikk. En intern størrelsesmarkør i hver prøve brukes til å bestemme lengden på fragmentene. Allelene framkommer som topper i diagram. Disse tallfestes på bakgrunn av fragmentlengde, og tallkombinasjonen gir en DNA-profil.

MitokondrieDNA

Mitokondriene i en celle har sitt eget lille DNA som er forskjellig fra DNA i kjernen. Mitokondrielt DNA (mtDNA) arves fra mor. Det finnes genetiske markører for mtDNA, men dette anvendes sjelden da kjerneDNA gir mer individspesifikk informasjon. MtDNA er svært lite sammenlignet med kjerneDNA, men har den fordelen at hver celle kan inneholde mange kopier. Det kan være avgjørende hvis man arbeider med gammel og nedbrutt biologisk materiale.

Y-DNA

DNA-analysen er så sensitiv at for eksempel en nesten usynlig blodflekk vil kunne gi et resultat.  Alle biologiske spor er imidlertid ikke like godt egnet for analyse. Enkelte spor kan inneholde for lite DNA til at de lar seg analysere. Andre kan være for urene eller inneholde degradert DNA. Det er altså flere faktorer som påvirker suksessraten eller andelen prøver som gir et DNA-resultat.

Forskjellige typer biologisk materiale inneholder ulike mengder DNA. Vev og kroppsvæsker som blod og sæd inneholder relativt mye DNA. Epitelceller fra slimhinner er en bedre DNA-kilde enn epitelceller fra hud. Urin, avføring og oppkast inneholder svært lite DNA.

Ved prøvetakning er det om å gjøre å få mest mulig DNA og minst mulig smuss på vattpinnen. Jord, olje, impregnering og salt hemmer DNA-analysen. I tillegg kan prøvematerialet i seg selv inneholde hemmere som for eksempel rødfargen i blod, blåfargen i dongeristoff og urinstoffet (urea) i urin. Det biologiske sporlaboratoriet kan eventuelt ta i bruk spesialmetoder å fjerne hemmere.

Biologisk materiale brytes ned av bakterier samtidig som det er utsatt for kjemisk nedbrytning. Nedbrytningsprosessene fremskyndes av økt temperatur, fuktighet og UV- stråling fra direkte sollys. Miljøfaktorer blir derfor viktig både ved vurderinger under selve sporsikringen og ved oppbevaring av spormaterialet.

Mennesker avsetter mange biologiske spor i sine omgivelser, som hår og epitelceller fra hud eller slimhinne etter kontakt med en overflate. Dette må tas med i betraktningen når man har så sensitive analyser som dagens laboratorium.