Selve prøvetakningen foregår som en mindre operasjon, og utføres av en kirurg ved en nevrokirurgisk enhet. De fleste kirurger foretrekker at pasienten har narkose under inngrepet.
Når narkosen er gitt, vil hodet bli festet i en ramme slik at det holdes helt stille under inngrepet. Det vil så lages en åpning i hud og skalle, hvor prøven kan tas ut. Størrelsen og plassering av åpningen avhenger av hvor i hjernen prøven skal tas.
I de fleste tilfeller er det tilstrekkelig med et lite snitt på omtrent 4-5 centimeter i huden og et borehull i skallen på 10-15 millimeter, mens man noen ganger krever en større åpning for å sikre gode prøver.
Neste trinn er selve prøvetakningen. For å sikre at prøven blir tatt på rett sted, vil de fleste kirurger benytte visuelt veiledende hjelpemidler. Dette kan enten være et system for nevronavigasjon, som gir en referanse mot de tidligere utførte bildeundersøkelsene, eller en ultralydundersøkelse som gjøres mens prøven tas.
Hvis prøvetakningsområdet ligger helt i overflaten på hjernen, kan man bruke en liten tang for å ta ut litt av vevet. Hvis prøvetakningsområdet ligger dypere, kan man bruke en spesiell nål som føres inn til den ønskede dybden.
En hjernebiopsi tar fra 20 minutter til en time, avhengig av hvor prøvetakningsområdet i hjernen er og hvor mange prøver som skal tas. Tidsbruk i forbindelse med innledning og avvikling av narkosen kommer i tillegg, slik at biopsien totalt kan ta opptil 2 timer.